Группа биофизиков из МФТИ при участии иностранных коллег изучила кристаллизацию молекул мембранного белка бактериородопсина. Ученые показали, что большие кристаллы белка растут, «съедая» более мелкие кристаллы из небольшой области вокруг себя. Исследование опубликовало в журнале Crystal Growth&Design.

Что такое мембранные белки?

Мембранные белки — важная группа белков, представленных в любом живом организме. Они находятся на поверхности клеточных мембран (или даже пронизывают их насквозь)и выполняют множество разных функций, в основном связанных с приемом сигналов или передачей веществ через нее (оболочка сама по себе непроницаема для многих молекул). Например, мембранные белки участвуют в передаче сигнала нервными клетками, восстанавливая их состояние после прохождения нервного импульса, или реагируют на адреналин, заставляя клетки нашего организма усерднее работать в условиях стресса.

Сигнальный белок аррестин (желтый), связаный с&...

Сигнальный белок аррестин (желтый), связаный с мембранным белком родопсином (оранжевый). Аррестин блокирует передачу сигнала, не давая другим сигнальным молекулам связываться с рецептором. Изображение: Flickr/slaclab

Зачем получать их кристаллы?

Для того, чтобы хорошо понимать, как функционируют белки, очень важно знать их молекулярную структуру. Она определяет механизм взаимодействия белка с другими молекулами (например, адреналином). Зная структуру белка, можно компьютерными методами довольно точно подбирать молекулы, которые будут с ним взаимодействовать. Таким образом можно удешевить и ускорить разработку лекарств — более 60% лекарств используют именно мембранные белки в качестве мишени.

Для получения структуры белка ученые сначала получают кристаллы этих молекул, а затем исследуют их с помощью рентгеновского излучения, чтобы по картине рассеяния восстановить структуру белка — уложенные в правильную кристаллическую решетку, все атомы в молекуле многократно усиливают излучение строго в определенных направлениях, что позволяет точно определить местоположение атомов.

Одна из картин рассеяния рентгеновских луч...

Одна из картин рассеяния рентгеновских лучей на кристалле бактериородопсина и структура белка, полученная после обработки этой картины Изображение любезно предоставлено авторами исследования

Как получить кристалл?

Для того, чтобы получить кристалл белка, необходимы два условия. Во-первых, белковым молекулам должно быть «выгоднее» находиться внутри кристалла, чем в растворе. Этого добиться довольно просто — для этого достаточно подобрать подходящие компоненты раствора и их концентрации. Во-вторых, необходимо дать молекулам белка возможность свободно передвигаться в растворе, чтобы новые молекулы могли поступать к растущему кристаллу.

Если белок растворимый, оба условия выполнить относительно просто. Однако если белок не растворяется в воде (а все мембранные белки именно такие — для них родной средой является не раствор, а липидная мембрана), то возникают проблемы.

Даже если получится вытащить такой белок из мембраны прямо в раствор, чтобы дать ему возможность свободно передвигаться в пространстве, он просто потеряет свою форму, встретившись с другим окружением (говорят, что белок денатурирует). В таком случае никакой информации о его «родной» структуре мы, конечно, уже не получим. Для того, чтобы обеспечивать движение молекул белка в образце без потери нужной структуры, ученые используют особую среду для их роста — липидную кубическую фазу.

Липидная кубическая фаза в разрезе. Слева ...

Липидная кубическая фаза в разрезе. Слева внизу показан участок вдали от растущего кристалла, в правом верхнем углу — сам кристалл. Белковые молекулы переходят из кубической фазы в кристалл по промежуточным липидным слоям Изображение: Вадим Черезов/The Bridge Institute

Липидная кубическая фаза — особенная трехмерная структура, которую образуют некоторые липиды (молекулы, из которых состоят липидные мембраны) при определенных температурах и концентрациях. Кубическая фаза образует в пространстве сложную двумерную поверхность, по которой мембранные белки могут добраться до растущего кристалла, не выходя из комфортной для них мембраны.

Это немного похоже на то, как люди гуляют по парку — несмотря на то, что тропинки (одномерные) в парке расположены далеко не везде, по ним можно добраться практически до любой точки двумерного парка. Так же и здесь — с той лишь разницей, что «тропинки» для мембранных белков в виде поверхности кубической фазы двумерны, а «парк» трехмерный (все пространство).

Гайд-парк в Лондоне Фотография: Jason Hawk...

Гайд-парк в Лондоне Фотография: Jason Hawkes/freelance

Благодаря такой структуре белки могут «путешествовать» по раствору и обеспечивать растущий кристалл новыми молекулами, при этом не выходя из своей среды обитания — липидной мембраны.

Стоит отметить, что использование такой сложной техники для получения кристаллов уже имеет хорошие результаты. Из всех структур мембранных белков, известных на данный момент, кристаллы для получения 40% из них были получены при помощи кристаллизации в липидной кубической фазе (или, как ее называют ученые, кристаллизации in meso).

Что сделали авторы?

В своей работе авторы исследовали рост кристаллов бактериородопсина (который использовался в качестве примера мембранного белка) при помощи флюоресцентной микроскопии. На протяжении месяца ученые наблюдали за ростом кристаллов и смотрели, как меняется распределение бактериородопсина в образце со временем. Оказалось, что поначалу кристаллы образуются во всем образце достаточно равномерно, однако где-то через неделю вокруг кристаллов побольше образуются четкие обедненные зоны. В этих зонах есть только совсем небольшие кристаллы, а более крупные начинают появляться только за их пределами. Получается, что крупные растущие кристаллы берут материал для роста не из раствора, а «поедают» своих более мелких собратьев, которые оказываются неподалеку.

Видно, что вокруг растущего большого кристалла ...

Видно, что вокруг растущего большого кристалла (в центре) образуется зона, где нет кристаллов покрупнее, только совсем небольшие, в то время как вдали от него могут появляться кристаллы побольше (левый верхний угол). Изображение любезно предоставлено авторами исследования

Так же ученые обнаружили, что кристаллизация начинается не в случайных местах в образце, а по границам областей, по форме напоминающих пчелиные соты.

«Возможно, такая картина связана с тем, что кубическая фаза не однородна по всему образцу, а формирует небольшие домены, на границах которых кристаллизация наиболее вероятна. Судя по всему, мы смогли наблюдать эти домены, которые по неизвестной нам причине образуют такие «соты». Интересно, однако, что если мы научимся контролировать размер доменов, то возможно будет выращивать кристаллы больших размеров, соответственно, получать более качественные и точные структуры белков», комментирует Валентин Борщевский, главный автор статьи и руководитель группы микроскопии сверхвысокого разрешения.

Увеличенное изображение образца. Если приглядет...

Увеличенное изображение образца. Если приглядеться, можно заметить, что темные области по форме напоминают шестиугольники — такую форму, по предположению ученых, имеют области в липидной кубической фазе Изображение любезно предоставлено авторами исследования

Согласно данным California Biomedical Research Organisation, разработка принципиально нового лекарственного средства занимает в среднем 12 лет и, согласно исследованию в журнале Nature, требует затрат в 2.6 млрд долларов. Понимание того, как устроены мишени для лекарств (в 40% случаев это мембранные белки из класса GPCR), в перспективе позволит удешевить и ускорить процесс поиска лекарственных молекул, действующих на них, а так же позволит делать лекарства, действующие строго на один вид рецепторов, что снизит их побочные эффекты.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда.