Международная команда ученых, научилась определять пространственную структуру белка, полученную на рентгеновском лазере, используя атомы серы в его составе. Разработка является продолжением проекта группы профессора Вадима Черезова, профессора МФТИ и Университета Южной Калифорнии, по созданию эффективной методики исследования рецепторных белков. Подробное описание работы опубликовано в журнале Science Advances.

Рецепторные белки (GPCR) обеспечивают передачу сигналов внутрь клеток, тем самым позволяя им получать информацию об окружающей среде и взаимодействовать друг с другом. Благодаря этому мы можем видеть, испытывать чувства, поддерживать кровяное давление, т.е. все, что необходимо для функционирования организма. Нарушения в работе этих белков приводят к возникновению тяжелых заболеваний, например, слепоте. Разработка лекарств, восстанавливающих нормальное функционирование рецепторов, невозможна без точного понимания механизмов работы GPCR, который, подобно остальным белкам, определяется их пространственной структурой, иными словами тем, как свернут белок.

Наиболее подходящим методом для решения этой задачи является рентгеновская кристаллография. Для рентгеновских лучей кристалл является трехмерной дифракционной решеткой, в которой излучение рассеивается на атомах.

Рис. 1 Схема эксперимента по фемтосек...

Рис. 1 Схема эксперимента по фемтосекундной рентгеновской кристаллографии. С помощью инжектора (1) кристаллы белка, растворенные в липидной среде (2) просвечиваются рентгеновским лучом (5), после чего рассеянный луч попадает на детектор (6). Давление в инжекторе создается с помощью гидравлического поршня (3), для сохранения прямой формы липидной струи специально подают поток газа (4).

Отдельной проблемой при этом является получение кристалла белка. Для этого рецепторные белки необходимо извлечь из мембраны клетки и поместить в специальную липидную среду. Затем подбирая температуру и вещества, ускоряющие процесс осаждения, белок кристаллизуют.

Неприятной особенностью GPCR является то, что это очень подвижные и динамичные молекулы, часто меняющие свою пространственную структуру. Как следствие, для них сложно вырастить крупные кристаллы, которые необходимы для классической процедуры дифракции. Она предполагает достаточно продолжительное облучение кристалла под разными углами. Рентген ионизирует атомы, тем самым разрушая молекулы белка. Чтобы компенсировать этот эффект как раз и нужны большие кристаллы, размером в несколько десятков микрон.

Решение этой проблемы стало возможно благодаря новой экспериментальной методике рентгеновской дифракции. Ее разработкой в течение последних нескольких лет занимается международная команда ученых из Университетов штата Аризоны и Цюриха, Национальной лаборатории SLAC в Стэнфорде, института iHuman при Университете в Шанхае, Института Биофизики Китайской Академии Наук, центра CFEL в Гамбурге, Университета Южной Калифорнии и МФТИ. Одним из лидеров этого коллектива является Вадим Черезов, профессор университета Южной Калифорнии и МФТИ. В основе методики лежит использование рентгеновских источников нового поколения — лазеров на свободных электронах. Излучение от них настолько мощное, что оно полностью ионизирует атомы в кристалле при прохождении через него, по сути, разрушая его. Однако, за счет очень короткого времени лазерного импульса (порядка нескольких фемтосекунд, 10-15 с), получается заснять дифракционную картину до того, как атомы сдвинуться с места. Благодаря этому ученым удалось обойти трудности, связанные с размерами кристаллов.

Поскольку кристалл разрушается моментально, то померить его в различных ориентациях невозможно. Для решения этой задачи ученые собирают и обрабатывают данные от множества кристаллов. С помощью специального инжектора липидная среда, в которой находятся кристаллы, подается под рентгеновский импульс. Весь процесс напоминает выдавливание зубной пасты из тюбика.

В результате получаются миллионы дифракционных изображений, которые необходимо обработать: отобрать изображения с кристаллами, найти их ориентацию, затем собрать в трехмерную дифракционную картину. Для ее расшифровки нужно знать два параметра: амплитуду и фазу отраженного излучения. Значения амплитуд измеряются на детекторе в ходе эксперимента, а вот определение фазы — это нетривиальная задача, для решения которой существует несколько методов.

Например, если нам известен некий белок, обладающий похожей структурой, то можно использовать его в качестве первого приближения. Очевидно, что такое возможно не во всех случаях.

Другой популярный метод — использовать эффект известный как аномальное рассеяние. Он возникает, когда длина рентгеновской волны близка к энергии электронного перехода в атомах, в результате происходит поглощение и переизлучение волны. Как следствие, меняются амплитуды и фазы. Если очень точно измерить амплитуды, то на основе разности между ними становится возможным восстановить фазы. Однако большинство атомов, входящих в состав белков (углерод, кислород, азот) для этого не подходят. Достаточно тяжелым элементов, встречающимся практически во всех белках, является сера. Именно ей и воспользовались исследователи в текущей работе для восстановления фазы.

Для этого потребовалась разработка специального программного обеспечения. Из 7 миллионов полученных изображений необходимо было отобрать те, которые имеют диффракционные отражения. Затем определить ориентацию кристалла и интенсивность всех отражений, после чего собрать получившиеся данные вместе. В итоге было отобрано 600 тысяч дифракционных картин, используя которые, получилось восстановить структуру белка с разрешением в 2,5Å. Соединив эти данные с данными, полученными при другой длине волны рентгеновского излучения, у исследователей получилось поднять разрешение до 1,9Å. Такая точность позволяет не только определять структуры рецепторных белков с высокой точностью, но и увидеть молекулы воды и липидов, которые окружают их, что имеет огромное значение для понимания механизма работы белка и моделирования его взаимодействия с другими веществами.

«Когда я участвовал в работе по определению структуры первого рецепторного белка, у меня ушел примерно год на то, чтобы получить кристаллы достаточно большого размера для проведения классической рентгеновской дифракции. Мы надеемся, что разработанный нами метод позволит ускорить эту работу в несколько раз»,— комментирует значимость исследования профессор Черезов.

Из существующих 800 рецепторных белков на сегодняшний день нам известны структуры только 34. Разработанная учеными экспериментальная методика позволит значительно ускорить их исследования. Что в свою очередь поможет в создании новых эффективных препаратов против огромного количества заболеваний.

Рис. 2 Конечная структура аденозинового А2...

Рис. 2 Конечная структура аденозинового А2А рецептора, изучавшегося в данной работе. Желтые сферы — атомы серы, синие сферы — молекулы воды, синими полосами показана липидная мембрана.