Ученые из МФТИ и ОИЯИ в совместной работе увеличили точность обнаружения ценных кристаллов белков, размер которых ограничен парой микрон. Именно такие маленькие кристаллы используются сейчас для изучения структуры мембранных белков, знание которой очень важно для фундаментальных и прикладных фармацевтических исследований. Работа опубликована в престижном журнале Journal of American Chemical Society.

Рис. 1: Схематичное изображение установки CARS, применяемой учеными для поиска мельчайших кристаллов белка. Два лазерных луча (лазер 1 и лазер 2) скрещиваются на образце. Сигнал, полученный от высвеченной области, проходит через множество фильтров (в том числе поляризатор) и идет на детектор. Дальнейшая обработка позволяет сказать, есть в данной области белковый кристалл или нет. Изображение: пресс-служба МФТИ.

Белки: молекулярные машины, ценные для фармацевтов

Белки — важные молекулярные машины, которые выполняют большинство функций в организме человека. Особо среди них выделяются мембранные белки, «сидящие» на мембране каждой клетки в нашем теле: они переносят вещества, энергию и сигналы непосредственно внутрь клеток, позволяя им «общаться». Мембранные белки-рецепторы — самые популярные мишени для лекарств. На них действуют, по разным оценкам, до 60% современных препаратов — например, називин или плавикс (лекарство от инсульта). Активируя или деактивируя рецепторы, правильно подобранные препараты могут регулировать физиологические процессы, которые были нарушены во время болезни.

Знание структуры белка во много раз удешевляет и ускоряет поиск лекарств. Подробную структуру получают методом рентгеновской дифракции, для которого необходимо вырастить большой однородный кристалл белка. Рассеяние рентгеновских лучей на кристаллической решетке и дает затем структуру. Получить кристалл мембранного белка очень сложно. Особенно сложно это для важнейших рецепторных белков класса GPCR — в 2012 году за исследование их структуры была дана Нобелевская премия.

В настоящее время для изучения мембранных белков применяют рентгеновские лазеры на свободных электронах — сверхсовременные источники жесткого рентгеновского излучения. Их мощности достаточно, чтобы использовать совсем небольшие кристаллы. Проблема в том, что при росте таких кристаллов сложно понять, какого качества они выросли и выросли ли вообще. Для предварительной проверки качества в настоящее время применяется техника SONICC, основанная на наложении изображений от метода SHG (который способен «видеть» упорядоченные кристаллы сквозь неупорядоченную среду, в которой они растут) и UV-TPEF (особый вид микроскопии, который может видеть только специальные аминокислоты, которые входят в состав молекулы белка). Точности этого метода, однако, зачастую оказывается недостаточно для детекции кристаллов размером около микрона. Ученым из МФТИ и ОИЯИ удалось превзойти метод SONICC (точнее, его принципиального компонента SHG), показав при этом чувствительность к тонким особенностям структуры белка, имеющим чрезвычайно важное значение при дальнейшем исследовании.

CARS: поиск микронных кристаллов с увеличенной точностью

Для исследования кристаллов ученые применили метод P-CARS — особый вид спектроскопии. Он использует нелинейный оптический эффект и применяется, например, для визуализации с высоким разрешением процессов, происходящих в клетках. Для применения метода требуется два лазера, лучи которых скрещивают на образце с белковым кристаллом (рис. 1). Полученный сигнал фильтруется оптической системой, позволяя отличить области с белковым кристаллом от небелкового окружения. Сканируя отдельные точки образца по очереди, исследователи получают трехмерную картинку кристалла.

«Научному сообществу широко известна CARS-микроскопия, применяемая в основном для визуализации процессов, происходящих в клетке. Метод CARS также можно настроить для того, чтобы детектировать специфичные только для белков химические связи, получая возможность видеть «сквозь» среду, в которой растут кристаллы. Мы использовали метод на модельных белках бактериородопсине (мембранный белок) и лизоциме (водорастворимый белок», — пояснил нам Алексей Власов, сотрудник Лаборатории перспективных исследований мембранных белков МФТИ.

Оказалось, что в случае кристаллов бактериородопсина можно заранее заметить распространенный дефект кристалла, так называемое двойникование, что невозможно при использовании SHG — принципиального компонента метода SONICC (который «видит» упорядоченные кристаллы, не различая их состав). Двойникование часто не позволяет узнать структуру белка с достаточной точностью, усложняя поиск лекарств, однако заметить этот дефект для микроскопических кристаллов до сих пор можно было только после проведения затратных рентгеновских исследований. Метод CARS позволяет обнаружить его быстрее и проще.

На примере кристаллов лизоцима ученые показали значимое преимущество метода CARS, продемонстрировав, что в некоторых случаях он может видеть кристаллы, которые не может заметить SONICC.

Рисунок 2: Преимущество метода CARS перед SHG (основным компонентом SONICC): кристаллы лизоцима размером около 1 микрона легко заметны при использовании CARS (справа), однако не видны при применении SHG (слева). Изображение предоставлено авторами статьи.

Перспективы: оборудование нового поколения

Исследователи применили известный метод CARS к обнаружению белковых кристаллов и показали, что он по точности и чувствительности к важным дефектам кристаллов превосходит используемый в настоящее время SONICC. Учитывая, что CARS не превосходит SONICC по стоимости и сложности, можно ожидать его появление в коммерческих установках для кристаллизации следующего поколения. Более того, полученные фундаментальные результаты повысят качество кристаллизации мембранных белков, важных для фармакологии, ускорив появление новых лекарств с минимальными побочными эффектами и повышенной эффективностью.