В Институте теплофизики СО РАН проводятся исследования процесса укладки белков и занимается этим, казалось бы, нетипичным для физиков, и, в принципе, редким для отечественной науки направлением, коллектив под руководством гл.н.с., д.ф.-м.н. Сергея Федоровича Чекмарева.

С.Ф. Чекмарев

С.Ф. Чекмарев

Результаты исследований коллектива названы среди важнейших при подведении итогов за прошедший год.

По словам ученого, тема укладки (фолдинга) белков была и остается одной из центральных в молекулярной биологии. В последние годы интерес в немалой степени усилился: появилась целая коллекция белков, которые при неправильной укладке могут приводить к различным нейродегенеративным заболеваниям, причем как у животных, так и у людей. Например, болезни, вызываемые прионовыми белками, такие как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота («коровье бешенство»), детально изученная С. Прузинером (Нобелевская премия 1997 г.), и болезнь Крейтцфельдта — Якоба у людей.

Затраты на создание лекарств огромны, разработка одного обходится в несколько миллиардов долларов. Однако, как и во многих других современных технологиях, существенного сокращения затрат на стадии разработки можно достичь путем применения компьютерного моделирования. Неслучайно достижения в области методов моделирования химических систем были отмечены в 2013 г. Нобелевской премией (М. Карплус, М. Левитт и А. Варшел).

Как теплофизики пришли к исследованию укладки белка?

В 80-90-е годы в Институте теплофизики был один из наиболее сильных коллективов по исследованию кластеров (или нанокластеров, как сейчас принято говорить). Занимались и экспериментами, и моделированием. Его группа применяла при моделировании методы молекулярной динамики (численное решение уравнений Ньютона для системы взаимодействующих частиц — атомов или молекул).

"В частности, в конце 90-х мы придумали метод контролируемого перемещения системы по поверхности потенциальной энергии путем запирания молекулярно-динамической траектории в бассейны притяжения. Он позволял эффективно оценивать скорости переходов между интересующими состояниями системы.

Наибольший интерес, конечно, представляли металлические и полупроводниковые кластеры, с которыми имеют дело в различных технологиях. Однако они требуют квантово-механического описания, что радикально увеличивает объем вычислений. Чтобы проверить возможности моделирования металлических кластеров, мы вместе с группой В. Бонасис-Котецки из Университета Гумбольдта в Берлине, известными специалистами в этой области, попробовали применить разработанный метод к исследованию кинетики маленького кластера — четырехмера золота. Это вылилось в три месяца вычислений в пересчете на один процессор. Если бы применялась обычная молекулярная динамика, времени потребовалось бы еще больше. Стало очевидно, что заниматься моделированием кинетики металлических кластеров еще рано, нужно поискать другие применения метода.

Так мы пришли к исследованию процесса укладки белков, для которого можно было использовать классическую динамику", — рассказал исследователь.

По мнению ученого, с точки зрения моделирования динамика белков мало чем отличается от динамики кластеров, ведь белок — это так же конечная система атомов, связанная силами межатомного притяжения, только у нее состав другой. Белок синтезируется на рибосоме в клетке и представляет собой цепочку из аминокислотных остатков, соединенных довольно прочными связями. Имеется 20 таких «стандартных» остатков. Их последовательность, которая для каждого белка кодируется соответствующим геном, определяет свойства белка. В организме белки выполняют широкий набор функций — работают в качестве катализаторов химических реакций, осуществляют защиту от токсинов путем связывания с ними, участвуют в транспорте малых молекул, передают сигналы между клетками и т.д. Чтобы выполнять свою функцию, белок должен свернуться в компактную структуру, причем так, чтобы все группы атомов, необходимые для выполнения этой функции, были бы доступны, т.е., оказались на поверхности белка, а не внутри. Такую функциональную структуру называют нативной и она в общем случае для каждого белка — одна.

Сотрудничество с М.Карплусом, основателем направления

"Когда мы решили применить разработанные нами методы к динамике укладки белков- это было в начале 2000-х — я послал наши статьи по кластерам М. Карплусу и спросил, не мог бы он поделиться с нами «полем сил» для расчета белков. Ну а если ему интересно попробовать наши методы для белков, можно было бы сделать что-то вместе, что было бы намного эффективнее.

Мартин Карплус — американский химик-теоретик, лауреат Нобелевской премии по химии за 2013 год. Исследования Карплуса затрагивают такие разделы науки как физическая химия, ЯМР-спектроскопия, химическая кинетика, квантовая химия и, в значительной степени, методы молекулярной динамики применительно к моделированию биологических макромолекул. В честь Карплуса названо уравнение, описывающее корреляцию между константой взаимодействия и двугранным углом в ЯМР-спектроскопии белков.

Он быстро отреагировал и спросил, не может ли кто-нибудь из нашей лаборатории приехать к нему. Так началось наше сотрудничество, которое продолжается до сих пор. Мы либо проводим совместные исследования, либо просто просим его посмотреть нашу работу. Всегда ценно услышать мнение одного из отцов-основателей", — рассказал ученый.

Одно из последних направлений наших работ — это гидродинамическое описание процесса укладки белков. Если рассматривать состояние белка как точку в конформационном пространстве, процесс укладки можно представить как поток изображающих точек белка из развернутого состояния в нативное. Проведя моделирование укладки методом молекулярной динамики, можно рассчитать локальные потоки пересборки белка в двух- или трехмерном пространстве коллективных переменных, т.е. переменных, которые описывают наиболее существенные изменения конформаций белка (здесь используются те же методы, что и при анализе изображений). Это позволяет построить траектории укладки, выявить их многообразие и т.д. Уже самые первые результаты оказались весьма неожиданными. Обнаружилось, что потоки укладки вовсе не следуют ландшафту поверхности свободной энергии системы, которая, по установившемуся мнению, определяет динамику укладки (ее даже так и называют — «потенциал средних сил»). «Правильный» потенциал состоит из двух компонент. Одна компонента определяет поток от источника потоков (развернутых состояний белка) к стоку (нативному состоянию), а другая канализирует эти потоки в пространстве состояний. Если бы последней не было, потоки разбрелись бы по всему пространству состояний и мы попали бы в ситуацию парадокса Левинталя. Далее обнаружилось, что, как правило, поле потоков укладки содержит вихри, которые описывают существенные конформационные превращения белка, но могут не оставлять следов на поверхности свободной энергии. При этом само поле потоков напоминает турбулентный поток жидкости. И эта аналогия оказалась намного глубже, чем можно было ожидать. Выяснилось, что потоки подчиняются тем же соотношениям подобия, что и скорости в турбулентном потоке жидкости, в частности, пространственные корреляционные функции потоков в точности соответствуют функциям, введенным А. Н. Колмогоровым в его знаменитых работах 1941 г. Все это подтвердилось для целого ряда белков, которые мы исследовали. Можно сказать, что клуб турбулентностей пополнился — наряду с гидродинамической, волновой, сверхтекучей и рыночной турбулентностями появилась еще и турбулентность укладки белков.

Как же белок находит это уникальную структуру среди всех других?

Переход первичной структуры полипептида (слева)...

Переход первичной структуры полипептида (слева) в третичную структуру (справа)

Одну из первых оценок дал С. Левинталь в 1969 г. Он показал, что, если бы белок из 100 аминокислотных остатков находил бы нативное состояние путем перебора всех возможных конформаций, это потребовало бы 1027 лет, в то время как в реальности белки такого размера укладываются в нативное состояние за времена порядка миллисекунд. Это означает, что белок находит нативную структуру неким определенным путем. И хотя с точки зрения физики это не было удивительным, поскольку изменение состояний любой системы атомов происходит не произвольно, а управляется взаимодействием атомов в ней, эта оценка, получившая название парадокса Левинталя, хорошо иллюстрирует сложность проблемы и часто цитируется.

Важнейшим шагом на пути исследования укладки белков был эксперимент К. Анфинсена (1962 г.), который на примере рибонуклеазы А показал, что после разворачивания белка за счет изменения внешних условий он спонтанно сворачивается в свою функциональную форму, когда исходные условия восстанавливаются. Отсюда следует, что нативная конформация определяется аминокислотной последовательностью, как К. Анфинсен сказал в своей нобелевской речи в 1972 году. Таким образом, для того, чтобы белок свернулся в свою нативную конформацию, в принципе не нужна никакая сложная машинерия. И, значит, процесс укладки можно изучать как «in vitro» (в пробирке), так и «in silico» (на компьютере).

В простейшем случае белок в ходе его укладки преодолевает барьер по свободной энергии между бассейнами полу-компактных и около-нативных состояний. Барьер формируется за счет того, что потенциальная энергия «тянет» белок к более компактному нативному состоянию, а энтропия — назад, поскольку число полу-компактных конформаций намного превышает число около-нативных. Высота этого барьера и определяет время укладки белка. В более сложных случаях, с которыми, как правило, приходится иметь дело, существуют несколько путей укладки с различными барьерами, или несколько барьеров на одном пути, или внепутевые бассейны метастабильных состояний (тупики), из которых нет прямого выхода в нативное состояние. Такие метастабильные состояния (конформации) могут играть роль латентных, конкурируя с нативным и мешая белку исполнять его функцию.

Не только методы моделирования, но задачи, возникающие при исследовании динамики нанокластеров и укладки белков во многом схожи. Например, охлаждение кластера из нагретого жидко-образного состояния в основное, твердотельное состояние весьма похоже на укладку белка из полу-компактного состояния в нативное. Тем более, что белок в нативном состоянии представляет собой очень плотное образование типа твердого тела. Если охлаждение кластера происходит резко, возникают метастабильные состояния типа стекол, подобные долгоживущим интермедиатам при укладке белков.

О перспективах исследований

В принципе, сейчас можно смоделировать процесс укладки любого белка, но это выливается в громадный объем вычислений. Поэтому предпринимаются большие усилия организовать вычисления так, чтобы расчет укладки белков был реально возможен. Наряду со «стандартными» параллельными расчетами на многопроцессорных суперкомпьютерах, такими как в проекте Blue Gene (IBM и ряд других организаций США), развиваются и другие подходы. Один из них — проект Folding@Home группы В. Пандэ из Стэнфорда, который использует распределенные вычисления с привлечением персональных компьютеров по всему миру (более трехсот тысяч активных ядер). Другой известный проект — суперкомпьютер Anton (по имени Антони Левенгука), который был создан под руководством Д. Шоу (D.E. Shaw Research, N.-Y.) для моделирования биологических макромолекул; в нем используются специализированные процессоры и архитектура, что позволяет ускорить вычисления на три порядка по сравнению с кластерами из тысяч ядер.

«С практической точки зрения самая важная задача моделирования — это вычисление нативного состояния белка по заданной аминокислотной последовательности. Мы этим не занимаемся, поскольку здесь просто нереально конкурировать с зарубежными группами — нужны совсем другие вычислительные мощности, вроде тех, о которых упоминалось выше. Наши работы относятся, скорее, к исследованию общих закономерностей укладки белков, т.е., к развитию теории укладки. В то же время, у них есть и практический аспект, это интерпретация результатов экспериментов», — рассказал С.Ф. Чекмарев.

По словам ученого, техника эксперимента быстро прогрессирует, особенно различные варианты спектроскопии одиночных молекул, позволяющие исследовать процесс укладки белков на субмикросекундном уровне. Поэтому неизбежно наступит время, когда можно будет измерять несколько характеристик белка в процессе укладки. Такие примеры уже дает, например, двумерная инфракрасная спектроскопия. Соответственно, возникнет необходимость строить и анализировать пути реакций в двух- или трех-мерном пространстве переменных. И этого нельзя достичь простым обобщением одномерных профилей свободной энергии на многомерное пространство, тут требуется принципиально другой подход, или, образно выражаясь, другой язык для интерпретации результатов измерений. Гидродинамическое описание процесса укладки белка как раз и предлагает такой язык. «В ближайшее время мы и собираемся этим заняться — промоделировать укладку белка, используя в качестве коллективных переменных содержание существенных элементов структуры белка, например, альфа-спиралей и бета-складок», — отметил Сергей Федорович.

По мнению ученого, судя по отечественным конференциям, в России почти никто не занимается моделированием динамики укладки белков. Есть коллективы, которые заняты разработкой теории укладки и биоинформатическим анализом баз данных. Наиболее известный из них трудится в Институте белка РАН в Пущино под руководством чл.-корр. РАН А. В. Финкельштейна. «Недавно, правда, в Новосибирском госуниверситете появилась зеркальная лаборатория структурной биоинформатики и молекулярного моделирования, которой руководят д-р. А. Каява (CNRS, Франция) и к.б.н. А. Бакулина (НГУ), чему мы очень рады и начали с ними сотрудничать. Поддерживаем также тесные отношения с отделом академика А. Н. Колчанова в Институте цитологии и генетики СО РАН», — резюмировал Сергей Федорович.

Подготовила Е.Садыкова, пресс-секретарь ИТ СО РАН